貨號：MS1516                                                 規(guī)格：100 管/96 樣

單寧含量試劑盒說明書 微量法

正式測定前取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

單寧是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的多元酚化合物，又稱植物多酚。具有*的化學(xué)性質(zhì)和 多種生理活性，如能與蛋白質(zhì)、生物堿、多糖結(jié)合；能與多種金屬離子發(fā)生絡(luò)合或靜電作用； 具有止血、抑制微生物、抗過敏、抗突變、抗腫瘤、抗衰老等生理活性。

測定原理：

單寧在堿性環(huán)境下與磷鉬酸反應(yīng)，生成藍(lán)色化合物，在 760nm 處有大吸收峰。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽和蒸 餾水。

試劑的組成和配制：

試劑一：液體 4mL× 1 瓶，4℃保存；

試劑二：液體 3mL × 1 瓶，4℃保存；

單寧的提取：

按照組織質(zhì)量（g）：蒸餾水體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 蒸餾水），充分勻漿后轉(zhuǎn)移到 EP 管中，80℃水浴提取 30min， 8000 g，25℃離心 10 min，取 上清液待測。

測定步驟：

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 760nm 處，蒸餾水調(diào)零；試劑一和試劑二 37℃預(yù)熱 10min 以上； 

2、操作表：

試劑名稱（µL）      對照管      測定管

樣本                        5

蒸餾水            135        130

試劑一           35         35

       混勻，室溫靜置 5min

試劑二           30          30

       混勻，室溫靜置 30min，760nm 處讀取吸光值 A，Δ A=A_測定 - A_對照，對照管只要做一管。

單寧含量計(jì)算：

a.用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下：

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸方程為 y = 1.6418x + 0.0134；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mg/mL)，y 為 ΔA (A_測定 - A_對照)。

2、按樣本鮮重計(jì)算：

單寧含量（mg /g 鮮重）= [(ΔA - 0.0134) ÷1.6418 × V1] ÷（W × V1 ÷ V2）= 0.609 × (Δ A - 0.0134) ÷ W。

3、按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單寧含量(mg/mg prot) = [(ΔA - 0.0134) ÷1.6418 × V1] ÷ (V1 × Cpr) = 0.609 × (ΔA - 0.0134) ÷ Cpr。

V1：加入樣本體積，0.005mL；V2：加入提取液體積，1mL； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W： 樣本鮮重，g。 

b.用 96 孔板測定的計(jì)算公式如下：

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸方程為 y = 0.8209x + 0.0134；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mg/mL），y 為 ΔA(A_測定  - A_對照)。

2、按樣本鮮重計(jì)算： 單寧含量(mg/g 鮮重) = [(ΔA - 0.0134) ÷ 0.8209 × V1] ÷ (W × V1 ÷ V2) = 1.218 × (ΔA - 0.0134) ÷ W。

3、按樣本蛋白濃度計(jì)算： 單 寧 含 量 (mg/mg prot)= [(Δ A-0.0134)÷0.8209 × V1]÷(V1 × Cpr)=1.218 × (ΔA-0.0134)÷Cpr。

V1：加入樣本體積，0.005mL；V2：加入提取液體積，1mL； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W： 樣本鮮重，g。 

注意事項(xiàng)：

1、 ΔA 控制在 0.02 ~ 0.5 范圍內(nèi)，若ΔA 大于 0.5，將樣本提取上清液用蒸餾水稀釋 10 倍后檢 測，計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。

2、 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為：0.025mg/mL ~ 0.5mg/mL。

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